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產(chǎn)品展示

科研實驗嘌呤霉素生物試劑規(guī)格來源介紹

科研實驗嘌呤霉素生物試劑規(guī)格來源介紹

價格:電議 型號:

原產(chǎn)地:中國大陸發(fā)布時間:2019/6/3 19:25:56

有效期4年
溶解性50 mg/mL in water
別名二鹽酸嘌呤霉素;嘌呤霉素鹽酸鹽
英文名稱Puromycin
CAS58-58-2
分子式C22H29N7O5·2HCl$r$
儲存條件-20℃
危險代碼R:22
純度PURITY: ≥99%
外觀(性狀)白色粉末
單位支
說明:蛋白質(zhì)合成抑

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有效期4年
溶解性50 mg/mL in water
別名二鹽酸嘌呤霉素;嘌呤霉素鹽酸鹽
英文名稱Puromycin
CAS58-58-2
分子式C22H29N7O5·2HCl
分子量544.44
儲存條件-20℃
危險代碼R:22
純度PURITY: ≥99%
外觀(性狀)白色粉末
單位
說明:蛋白質(zhì)合成抑制劑。抑制細(xì)菌、藻類原生物和哺乳動物細(xì)胞生長。
 
嘌呤霉素(Puromycin)是由白黑鏈霉菌(Streptomyces alboniger)發(fā)酵代謝產(chǎn)生的一種氨基糖苷類抗生素,通過抑制蛋白質(zhì)合成而殺死革蘭氏陽性菌,各種動物和昆蟲細(xì)胞。某種特殊情況下有效作用大腸桿菌。作用機(jī)制在于嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3’末端的類似物,能夠與核糖體的A位點結(jié)合并摻入到延伸的肽鏈中。嘌呤霉素同A位點結(jié)合后,不會參與隨后的任何反應(yīng),從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的提前終止并釋放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。
 
嘌呤霉素產(chǎn)生菌Streptomyces alboniger內(nèi)發(fā)現(xiàn)的pac基因編碼嘌呤霉素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAC),賦予機(jī)體對嘌呤霉素產(chǎn)生抗性。這一特性如今普遍應(yīng)用于篩選特定攜帶pac基因質(zhì)粒的哺乳動物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。
 
嘌呤霉素在細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選中的普遍應(yīng)用與慢病毒載體的特性有關(guān),現(xiàn)在商業(yè)化的慢病毒載體多數(shù)都攜帶pac基因。在某些特定情況下,嘌呤霉素亦可以用來篩選轉(zhuǎn)化攜帶pac基因質(zhì)粒的大腸桿菌菌株。
 
溶解性:溶于水,參考濃度50mg/ml。
 
使用方法
 
1.建議使用濃度
 
哺乳動物細(xì)胞:1-10 μg/mL,*佳濃度需要殺滅曲線來確定;
 
大腸桿菌:LB瓊脂培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)化pac基因的大腸桿菌,使用濃度為125μg/mL。注:使用嘌呤霉素篩選大腸桿菌穩(wěn)轉(zhuǎn)株需要精確的pH值調(diào)節(jié),而且受宿主細(xì)胞本身的影響。
 
2.溶解方法
 
用蒸餾水溶解嘌呤霉素配制成50 mg/ml的母液,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌后分裝于-20℃凍存;也可溶于甲醇,配制成10 mg/ml的儲存液。
 
3. 嘌呤霉素殺滅曲線的確定(以shRNA轉(zhuǎn)染或者慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)為例)
 
嘌呤霉素有效篩選濃度跟細(xì)胞類型、生長狀態(tài)、細(xì)胞密度、細(xì)胞代謝情況及細(xì)胞所處細(xì)胞周期位置等有關(guān)。為了篩選到穩(wěn)定表達(dá)的shRNA細(xì)胞株,確定殺死未轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的濃度嘌呤霉素至關(guān)重要。建議初次做實驗的客戶一定要建立適合自身實驗體系的殺死曲線(kill curve)。
 
1) Day 1:24孔板內(nèi)以5~8 x 104 cells/孔的密度鋪板,鋪足夠量的孔以進(jìn)行后續(xù)的梯度實驗。37℃細(xì)胞孵育過夜;
 
2) Day 2:a)準(zhǔn)備篩選培養(yǎng)基:含不同濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基(如0-15μg/mL,至少5個梯度);b)往孵育過夜后的細(xì)胞內(nèi)更換新鮮配制的篩選培養(yǎng)基;之后37℃孵育細(xì)胞;
 
3) Day 4:更換新鮮的篩選培養(yǎng)基,并觀察細(xì)胞存活率。
 
4) 根據(jù)細(xì)胞的生長狀態(tài),約2-3天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基;
 
5) 每日監(jiān)測細(xì)胞,觀察存活細(xì)胞率,從而確定抗生素篩選開始4-6天內(nèi)有效殺死非轉(zhuǎn)染或者所有非轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的藥物濃度。
 
4. 哺乳動物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選
 
等轉(zhuǎn)染含有pac基因的質(zhì)粒后,細(xì)胞在含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基中增殖,以篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子。
 
1)細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后,將細(xì)胞(原樣或稀釋)置于含有適當(dāng)濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
 
注意:當(dāng)細(xì)胞處于分裂活躍期時,抗生素作用*明顯。細(xì)胞過于密集,抗生素產(chǎn)生的效力會明顯下降。進(jìn)行細(xì)胞分盤使其密度不超過25%。
 
2)每隔2-3天,移除和更換含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基。
 
3)篩選7天后評估細(xì)胞形成的病灶。病灶可能需要額外的一周或者更多時間,這依賴于宿主細(xì)胞系和轉(zhuǎn)染篩選效率。注意:每日進(jìn)行細(xì)胞生長狀態(tài)的觀察。嘌呤霉素的篩選至少需要48h,有效濃度嘌呤霉素的篩選周期一般在3-10天。
 
4)轉(zhuǎn)移和放置5-10個抗性克隆到一個35mm的培養(yǎng)皿中,用選擇培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7天。此次富集培養(yǎng)是為日后的細(xì)胞毒性實驗做準(zhǔn)備。
 
注意事項
 
1)為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。
 
2)嘌呤霉素為有毒化合物,操作時請小心拿放。
 
  備注:產(chǎn)品信息可能會有優(yōu)化升級。請以實際標(biāo)簽信息為準(zhǔn)。

更新時間:2024/5/24 11:44:34

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