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主要用途 細胞ERK1/2激酶總活性光度法定量檢測試劑是一種旨在通過多肽底物，在ERK1/2激酶敏感性抑制劑存在與否的情況下，受到ERK1/2激酶磷酸化后，進而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應系統(tǒng)，測定產生ADP過程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應， 即采用光度法測定其氧化后吸光峰值的變化，以分析細胞裂解樣品中ERK1/2激酶總活性的權威而經(jīng)典的技術方法。該技術經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解萃取液樣品（動物、人體）、部分或完quan純化酶樣品中ERK1/2激酶的定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，高度敏感。 細胞ERK1/2激酶總活性光度法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）技術背景 細胞外信號調節(jié)性激酶（extracellular signal regulated kinase；ERK；EC），又稱為經(jīng)典促分裂素原活化蛋白激酶（classical mitogen activated protein kinase），屬于促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）一類中，包括JNK（c-Jun amino terminal kinase）、ERK、P38、Big MAPK1等的一員。在哺乳動物細胞中，促分裂素原活化蛋白激酶通路包含有三大通路，Erk信號通路是其中，高度進化保留。Erk/MAPK是脯氨酸定向性絲氨酸/蘇氨酸（serine/threonine）蛋白激酶，在大多數(shù)組織中表達。和P38、JNK通路一起，將細胞外信號轉化為特定細胞反應。Erk通路受到各種刺激例如生長因子、細胞因子、病毒感染、腫瘤因子等，由受體信號傳導到細胞核內的目標分子，通過Ras磷酸化Raf，進而激活MAP激酶激酶1和2（MEK1和2），再磷酸化Erk激酶，然后激活一系列下游底物，包括核糖體S6激酶（ribosomal S6 kinase；RSK）、轉錄因子、髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein）等，以調節(jié)細胞生長、繁殖、分化、壓力生存（stress survival）、減數(shù)分裂、有絲分裂、細胞形態(tài)維持、細胞骨架的構建、細胞凋亡和細胞的惡變。Erk激酶有5型，其中主要分為1型和2型，其中1型又稱為MAPK3，44Kd分子量，主要調節(jié)胸腺細胞成熟；2型又稱為MAPK1，42Kd分子量。Erk通路異常，與乳腺癌、卵巢癌、列腺癌等發(fā)生有關。Erk磷酸化目標序列為髓鞘堿性蛋白性多肽ATGPLSPGPFGRR。基于底物ATGPLSPGPFGRR，在ERK1/2激酶敏感性抑制劑FR180204（5-(2-Phenyl-pyrazolo[1,5-a]pyridin-3-yl)-1H-pyrazolo[3,4-c]pyridazin-3-ylamine）的存在與否的情況下，受到ERK1/2激酶的磷酸化，獲得產物磷酸化多肽，進而通過丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應系統(tǒng)中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的變化（340nm），來定量分析ERK1/2激酶的總活性。其反應方式為： 細胞ERK1/2激酶總活性光度法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）產品內容 清理液（Reagent A） 毫升 裂解液（Reagent B） 毫升 緩沖液（Reagent C） 毫升 酶促液（Reagent D） 微升 反應液（Reagent E） 微升 底物液（Reagent F） 微升 陰性液（Reagent G） 微升 性液（Reagent H） 微升 產品說明書 1份 保存方式 保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，嚴格避免光照和反復凍融;保質期：6月 細胞ERK1/2激酶總活性光度法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）用戶自備 ERK1/2激酶：用于抑制劑篩選 1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器 15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器 細胞刮脫棒：用于貼壁細胞脫離 （微型）臺式離心機：用于樣品預處理 比色皿或96孔板：用于光度分析操作的容器 分光光度儀或酶標儀：用于樣品光度分析 實驗步驟 一、 待測樣品準備 1． 準備好75cm2細胞培養(yǎng)瓶或100mm細胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細胞（1至5 X 107細胞） 2． 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面 3． 小心抽去清理液 4． 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：避免使用胰酶消化） 5． 加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻細胞 6． 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始） 7． 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g 8． 小心抽去上清液 9． 加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混勻 10． 轉移到預冷的1.5毫升離心管 11． 強力渦旋震蕩15 12． 置于冰槽里孵育30分鐘 13． 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415） 14． 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管 15． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1） 16． 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作 二、 測定準備 1． 準備好待測樣品（例如細胞裂解懸液等），置于冰槽里 2． 設定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長為340nm，間隔1分鐘，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零 3． 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度 三、 背景對照測定 1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿 2． 加入xx微升酶促液（Reagent D） 3． 加入xx微升反應液（Reagent E） 4． 加入xx微升底物液（Reagent F） 5． 放進30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘 6． 加入xx微升陰性液（Reagent G） 7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3之內） 8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)5分鐘 四、 樣品總活性測定 1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿 2． 加入xx微升酶促液（Reagent D） 3． 加入xx微升反應液（Reagent E） 4． 加入xx微升底物液（Reagent F） 5． 放進30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘 6． 加入5微升待測樣品（注意：50微克細胞裂解蛋白；樣品須溶解） 7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3之內） 8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數(shù)：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)5分鐘 五、 樣品非特異活性測定 檢測開始，移取xx微升緩沖液（Reagent C）到1.5毫升離心管，分別加入xx微升性液（Reagent H）和待測樣品（注意：50微克細胞裂解蛋白），混勻后，放進30℃培養(yǎng)箱里孵育30分鐘。然后繼續(xù)下列操作。 1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿 2． 加入xx微升酶促液（Reagent D） 3． 加入xx微升反應液（Reagent E） 4． 加入xx微升底物液（Reagent F） 5． 放進30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘 6． 加入20微升上述預處理的待測樣品 7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3之內） 8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品非特異活性讀數(shù)：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)5分鐘 六、 計算樣品活性 1） 樣品總活性和非特異活性計算 2）樣品特異活性計算 七、酶標儀測定 1） 樣品總活性測定 1． 在96孔板上做好相應標記：背景對照和樣品 2． 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到96孔板里 3． 分別加入xx微升酶促液（Reagent D） 4． 分別加入xx微升反應液（Reagent E） 5． 分別加入xx微升底物液（Reagent F） 6． 輕輕搖動96孔板 7． 在30℃溫度下孵育3分鐘 8． 分別加入xx微升陰性液（Reagent G）或待測樣品（50微克細胞裂解懸液蛋白）到相應孔里（注意：樣品須清澈） 9． 輕輕搖動96孔板 10． 即刻放進酶標儀檢測：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù) 11． 活性計算： 2） 樣品非特異活性測定 檢測開始，移取xx微升緩沖液（Reagent C）到1.5毫升離心管，分別加入xx微升性液（Reagent H）和待測樣品（注意：50微克細胞裂解蛋白），混勻后，放進30℃培養(yǎng)箱里孵育30分鐘。然后繼續(xù)下列操作。 1． 在96孔板上做好相應標記：待測樣品 2． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到96孔板里 3． 加入xx微升酶促液（Reagent D） 4． 加入xx微升反應液（Reagent E） 5． 加入xx微升底物液（Reagent F） 6． 輕輕搖動96孔板 7． 在30℃溫度下孵育3分鐘 8． 加入20微升上述預處理的待測樣品 9． 輕輕搖動96孔板 10． 即刻放進酶標儀檢測：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù) 11． 活性計算： 3） 樣品特異活性計算 八、抑制劑篩選 1． 在96孔板上做好相應標記：背景、完quan活性和待測抑制劑樣品 2． 按下表加入試劑，進行樣品預處理 內容物 空背景對照 樣本背景 完quan酶活性 待測抑制劑酶活性 緩沖液（Reagent C） xx微升 xx微升 xx微升 xx微升 陰性液（Reagent G） xx微升 xx微升 xx微升 —— 待測抑制劑 —— xx微升 ―― xx微升 用戶自備的純化酶 —— —— xx微升（1毫單位） xx微升（1毫單位） 96孔板每孔總量 空背景對照孔 （xx微升） 樣本背景孔 （xx微升） 完quan活性孔 （xx微升） 待測抑制劑樣品孔 （xx微升） 輕輕搖動96孔板，混勻，放進30℃培養(yǎng)箱里孵育30分鐘。然后進行下列操作 3． 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的96孔板的所有孔里 4． 分別加入xx微升酶促液（Reagent D） 5． 分別加入xx微升反應液（Reagent E） 6． 分別加入xx微升底物液（Reagent F） 7． 輕輕搖動96孔板 8． 在30℃溫度下孵育3分鐘 9． 加入20微升上述預處理的待測樣品 10． 即刻放進30℃酶標儀檢測：測讀30分鐘 11． 抑制活性計算： 注意事項 1． 本產品為20次操作 2． 操作時，須戴手套 3． 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次 4． 樣品處理忌用磷酸緩沖溶液 5． 樣品須澄清，至關重要 6． 如果出現(xiàn)明顯的干擾現(xiàn)象，建議使用樣本背景對照去除任何內源性干擾因子 7． 加入樣品啟動反應后3內即刻光度測定 8． 測定值由高到低變化；測定可持續(xù)30分鐘 9． 光度測定后，比色皿須清洗徹di 10． 樣本測定0分鐘讀數(shù)高于5分鐘讀數(shù)表明具有酶活性 11． 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/5微升（本公司提供 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1） 12． 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度 13． ERK激酶活性單位濃度定義：在30℃溫度下，pH 7.5條件下，每分鐘內能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個活性單位 14． 本公司提供系列蛋白激酶檢測試劑產品 質量標準 1． 本產品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定 2． 本產品經(jīng)鑒定檢測敏感 使用承nuo 秉著“信譽至上、客戶滿意、質量承nuo”的宗旨為我們的用戶提供優(yōu)zhi產品和服務。用戶收到貨后，應按照產品說明書上的規(guī)定妥善保管并在有xiao期內使用。我們的產品在銷售已作嚴格的質量鑒定，bao證說明書所述的使用效果。在貨到后10天內若發(fā)現(xiàn)確屬本產品的質量問題，請立即以書面形式（實驗報告）與本公司聯(lián)系，并將該產品退回，經(jīng)檢驗確系產品質量所致，本公司負責更換產品。如系使用者錯誤操作所致，本公司不承擔由此造成的損失。 友情提醒 IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。 訂購信息 單組分訂購信息 編號名稱規(guī)格 GMS50056.1.3細胞ERK1/2激酶總活性光度法定量檢測試劑盒20次 GMS50056.1.3A清理液（Reagent A） 毫升 GMS50056.1.3B裂解液（Reagent B） 毫升 GMS50056.1.3C 緩沖液（Reagent C） 毫升 GMS50056.1.3D酶促液（Reagent D） 毫升 GMS50056.1.3E 反應液（Reagent E） 毫升 GMS50056.1.3F底物液（Reagent F） 毫升 GMS50056.1.3G陰性液（Reagent G） 毫升 GMS50056.1.3H性液（Reagent H） 毫升 試劑盒訂購信息 產品編號 名稱 規(guī)格 GMS50056.1 細胞ERK1/2激酶總活性光度法定量檢測試劑盒 20次 GMS50056.2 組織ERK1/2激酶總活性光度法定量檢測試劑盒 20次 GMS50159.1 細胞ERK1激酶活性光度法定量檢測試劑盒 20次 GMS50159.2 組織ERK1激酶活性光度法定量檢測試劑盒 20次 GMS50159.3 細胞ERK2激酶活性光度法定量檢測試劑盒 20次 GMS50159.4 組織ERK2激酶活性光度法定量檢測試劑盒 20次
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王小姐
