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技術(shù)文章

谷氨酸(Glu)含量檢測試劑盒說明書

點(diǎn)擊次數(shù):16911   發(fā)布時(shí)間:2022/12/26 12:58:10

 試劑一:液體 100mL×1 瓶,4℃保存;

試劑二:液體 5mL×1 瓶,4℃保存;

試劑三:粉劑×1 瓶,-20℃保存,臨用前加入 40mL 試劑一;

試劑四:粉劑×1 瓶,-20℃保存,臨用前加入 2.5mL 試劑二;

標(biāo)準(zhǔn)品:液體 0.5mL×1 支,4℃保存。10μmol/mL 谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品。

 

Glu 廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,不僅是組成蛋白質(zhì)的 20 種氨基酸,而且通過轉(zhuǎn)氨基作用參與多種氨基酸合成,是生物體內(nèi)主要氨基來源。此外,Glu 還是味精的主要有效成分,常用做食品添加劑以及香料生產(chǎn)。

谷氨酸脫氫酶 (GDH) 催化谷氨酸和 NAD 生成α-酮戊二酸、NADH NH4+ ,引起 340nm 處吸光度的上升,通過測定 340nm 吸光度的變化,計(jì)算谷氨酸含量。

紫外分光光度計(jì)、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL 石英比色皿、研缽、冰、蒸餾水。

細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品:收集細(xì)胞或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照每 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL試劑一,超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞 (功率 20%,超聲 3s ,間隔 10s,重復(fù) 30 ),10000rpm ,常溫離心 10min ,取上清待測。

 

稱取約 0. 1g 組織,加入 1mL 試劑一進(jìn)行冰浴勻漿,10000 rpm,常溫離心 10min ,取上清待測。

1 、紫外分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長至 340nm ,蒸餾水調(diào)零。

2 、標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

將標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋為 2.5 、1.25 、0.625 、0.313 、0. 156 、0.078 0.039μmol/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

3 、在 1 mL 石英比色皿中加入下列試劑:

a.

標(biāo)準(zhǔn)管:在 1 mL 石英比色皿中加入 200μL 標(biāo)準(zhǔn)溶液、800μL 試劑三和 50μL 試劑四混勻,

立即記錄 340nm 20s 時(shí)的吸光值為 A1 5min20s 時(shí)的吸光值 A2 ,計(jì)算∆A=A2-A1。

b.

測定管:在 1 mL 石英比色皿中加入 200μL 樣本、800μL 試劑三和 50μL 試劑四混勻,立即

記錄 340nm 20s 時(shí)的吸光值為 A1 5min20s 時(shí)的吸光值 A2 ,計(jì)算∆A=A2-A1。

1 ,共 2 1 、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:

以谷氨酸含量 (µmol/mL) x 軸,標(biāo)準(zhǔn)管∆A y 軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 y=kx+b 。將測定管∆A

入方程得到 x 值。

2 、氨基酸含量計(jì)算:

(1) 按照蛋白濃度計(jì)算

谷氨酸含量 (µmol/mg prot) =x×V 樣本÷ (Cpr×V 樣本) =x÷Cpr。

(2) 按照樣本鮮重計(jì)算

谷氨酸含量 (µmol/g 鮮重) =x×V 樣本÷ (W÷V 樣總×V 樣本) =x÷W。

(3) 按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

谷氨酸含量 (μmol/10 4 cell) x×V 樣本÷ (500÷V 樣總×V 樣本) =0.002x。

V 樣總:加入提取液體積,1mL;V 樣本:加入的樣本體積,0.2mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;

W:樣本鮮重,g;1000:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),1000 萬。

為提高檢測靈敏度,測定管的吸光值應(yīng)小于 1 ∆A 小于 0.4 ,若大于此值則需要將上清液用試

劑一稀釋至適當(dāng)倍數(shù)后測定。

原創(chuàng)作者:上海極威生物科技有限公司

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