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技術(shù)文章

三聚氰胺快速檢測試劑盒使用說明書2022

點(diǎn)擊次數(shù):16915   發(fā)布時間:2022/12/26 11:43:03

 三聚氰胺快速檢測試劑盒使用說明書

【測定原理】

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測牛奶和水產(chǎn)等樣本中的三聚氰胺,在微孔條上預(yù)包被上偶聯(lián)抗原,利用抗原與抗體的特異性免疫化學(xué)反應(yīng)的原理來進(jìn)行,樣本中的三聚氰胺和微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗三聚氰胺抗體,加入酶標(biāo)記物后,用TMB底物顯色,樣品中的三聚氰胺含量與樣品的吸光度值呈反比,與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出三聚氰胺含量。

【試劑盒技術(shù)指標(biāo)】   

規(guī)       格:96/

度: 1ppb

檢測時間: 45min

樣本檢測下限:

………………………………………………20 ppb

………………………………………………16 ppb

/奶 粉(處理法二)………………………  1 ppb

組織(雞/////肝臟)……………………2 ppb

    …………………………………………100 ppb

     …………………………………………20 ppb

    …………………………………………  4 ppb

交叉反應(yīng)率

三聚氰胺  …………………………………………100%

三聚氰酸……………………………………………60%

    ……………………………………………< 1%

三嗪二銨…………………………………………< 1%

回收率

/奶 粉  ……………………………………90±15%

     …………………………… 85±10%

     …………………………… 85±10%

     …………………………… 80±10%

試劑盒組成   

1、 微量測試孔:1×96孔板(12×8孔)

2、 標(biāo)準(zhǔn)液X6瓶:(1ml/瓶)0ppb、1ppb、3ppb9ppb、27ppb81ppb

3、 高濃度標(biāo)準(zhǔn)品:×1瓶:(1ml/瓶) 1ppm

4、 酶標(biāo)記物    7ml………………… 紅色帽

5、 抗體工作液  7ml………………… 綠色帽

6、 底物A液     7 ml………………… 棕色帽

7、 底物B液     7 ml …………………黑色帽

8、 終止液      7 ml …………………黃色帽

9、 20X濃縮洗滌液40 ml……………白色

10、 2X濃縮復(fù)溶液 50 ml ……………藍(lán)色帽

所用儀器、試劑   

具備的儀器:微孔板、酶標(biāo)儀、勻質(zhì)器、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平(感量0.01g

微量移液器:單道 20ul200ul100ul1000ul

多道 250 ul

    劑: 乙腈 、氫氧化鈉 、濃鹽酸、去離子水、正己烷、甲醇

【實(shí)驗(yàn)前溶液配制】

配液1、2X濃縮復(fù)溶液用去離子水按照11稀釋1 份濃縮復(fù)溶液+1份去離子水)用于樣本的復(fù)溶。
配液2、40ml濃縮洗滌液(20倍濃縮)用去離子按照119稀釋(1份濃縮洗滌液+19份去離子水),或按 所需用量配制洗滌液。

配液3   1M HCl 溶液8.6mlHCl加去離子水定容至100ml。

配液4   1M NaOH 溶液稱取4g NaOH加去離子水定容至100ml。

配液5   0.1M NaOH 溶液稱取0.4g NaOH加去離子水定容100ml。

配液6   乙腈-0.1M NaOH溶液84ml乙腈和16ml 0.1M NaOH混合均勻。

樣本前處理步驟   

樣本處理前須知

處理任何樣本時都必須注意:

a)本試劑盒所檢測的組織樣本包括:動物組織、禽類和水產(chǎn)組織。eg:雞、鴨、豬、牛、羊、兔、魚、蝦等。

b)實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭在吸取不同的試劑時要更換吸頭。

c實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈,必要時可對實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行清潔,以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

樣本處理方法

a)牛奶專用樣本處理方法:

1、 取牛奶樣本600µl2ml的離心管中,加入1ml乙腈,充分振蕩混勻;4000r/min以上離心5min;

2、 100µl上清液,再加入500µl復(fù)溶液(見配液1),混勻;

3、 50µl用于分析。樣本稀釋倍數(shù):16

b)奶粉;奶酪專用樣本處理方法:

1、稱取2.0±0.05g奶粉樣本至50ml離心管中,加入4ml甲醇,充分振蕩;

2、154000r/min以上離心10min,取100µl上清液,再加入900µl復(fù)溶液(見配液1),混勻;取50µl用于分析。樣本稀釋倍數(shù):20

c)飼料樣品處理方法:

1、將飼料樣品研碎,稱2.0±0.05g研碎的飼料樣品,加入2ml 1M HCl,加入16ml去離子水均質(zhì)。

2、旋流1min,放振蕩器上振蕩2min154000r/min上離心15min,取出10ml上清液并用1M NaOHpH值調(diào)至6-8。(注:因飼料樣品的不同,加入1M NaOH的量有所差異,根據(jù)情況調(diào)節(jié),一般加入范圍是0.5ml1ml之間)。

3、15℃,4000r/min以上離心15min,吸出上清液。(如果上清仍然渾濁可提高轉(zhuǎn)速或用濾紙過濾)。

4、用稀釋后的復(fù)溶液10倍稀釋上清液(取100µl上清液加入900µl稀釋后的復(fù)溶液,并且混合均勻,混合30s)。

5、取50µl進(jìn)行分析樣本稀釋倍數(shù):100

d)牛奶/奶粉樣本處理方法(處理法二)

1、2ml奶樣或2g奶粉至離心管中;加入8ml乙腈-0.1M NaOH充分振蕩2min,154000r/min以上離心10min,取4ml上清液在56℃條件下氮?dú)饣蚩諝饬鞔?/font>至wan干燥;

2、1ml正己烷溶解干燥的殘留物后,再加入1ml釋后的復(fù)溶液混合30s,離心去除上層正己烷相;

3、50µl用于分析。樣本稀釋倍數(shù):1倍定量下限定為:2ppb

e)組織(雞/////肝臟)樣本處理方法:

12.0±0.05g均勻組織樣本于50ml離心管中;加入8ml乙腈-0.1M NaOH充分振蕩2min15℃ 4000r/min以上離心10min,取2ml上清液在56℃條件下氮?dú)饣蚩諝饬鞔抵羨an干燥;

2、  1ml正己烷溶解干燥的殘留物后,再加入1ml稀釋后的復(fù)溶液混合30s,離心去除上層正己烷相;

3、  50µl用于分析。樣本稀釋倍數(shù):2 倍    

f)蛋類樣本處理方法:

1、用均質(zhì)器低速均勻樣本(蛋清、蛋黃或全蛋)稱取2.0±0.05g均質(zhì)過的樣本,加入8ml乙腈-0.1M NaOH充分振蕩2min;(注:蛋清含蛋白成份高,加入提取液后會形成一團(tuán)膠狀物,較蛋黃或全蛋難易搖勻,此情況為正,F(xiàn)象不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果)15℃4000r/min以上離心10min,取1ml上清液在56℃條件下氮?dú)饣蚩諝饬鞔抵羨an干燥;

2、  1ml正己烷溶解干燥的殘留物后,再加入1ml稀釋后的復(fù)溶液混合30s,離心去除上層正己烷相;

3、  取下層相用稀釋好的復(fù)溶液按13 50µl樣本液加150µl稀釋后的復(fù)溶液)稀釋,混合30s;

4、  50µl用于分析。樣本稀釋倍數(shù):20

g血清樣本處理方法:

1、0.5ml血清樣本于50ml離心管中;

2加入2ml乙腈-0.1M NaOH充分振蕩2min,15℃ 4000r/min以上離心10min,取1ml上清液在56℃條件下氮?dú)饣蚩諝饬鞔抵羨an干燥;

31ml正己烷溶解干燥的殘留物后,再加入1ml稀釋后的復(fù)溶液混合30s,離心去除上層正己烷相;

450µl用于分析。

樣本稀釋倍數(shù):4 

酶標(biāo)免疫分析程序   

操作步驟:   

1將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出,置室溫(20-25℃)平衡30min以上注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、、按板架及需要取出微孔條,將不用的微孔放入自封袋,保存于2-8

3、編號:將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

4、標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50µl /,然后加酶標(biāo)記物50μl/,再加入抗體工作液50µl/。輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板,25℃環(huán)境反應(yīng)30min。

5、取出用洗滌液按每孔250μl洗板4-5次,每次浸泡15-30秒,拍干(拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭破)

6、顯色:每孔加入底物液A50µl再加B50µl,輕輕振蕩混勻,25℃環(huán)境避光顯色15min

7、測定:每孔加入終止液50µl,輕輕振蕩混勻,設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處(建議用雙波長450/630nm檢測在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)),測定吸光度值(OD值)。

結(jié)果判定   

結(jié)果判定有兩種方法,粗略判定可用第1種方法,定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與三聚氰胺的含量成負(fù)相關(guān)。

1、粗略判定:

    用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.3,樣本2的吸光度值為1.0,標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是:0ppb為2.243; 1ppb為1.816;3ppb為1.415;9ppb為0.74;27ppb為0.313;81ppb為0.155。則樣本1的濃度范圍是27ppb-81ppb; 樣本2的濃度范圍是3ppb-9ppb,乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中三聚氰胺實(shí)際濃度。

2、定量判定:

所獲得的每個濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值(B)除以第yi個標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(B0)再乘以100%,即百分吸光度值。

百分吸光度值(%)=

B

×100%

B0

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo),以三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ng/ml)的半對數(shù)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度,乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中三聚氰胺實(shí)際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算,更便于大量樣品的準(zhǔn)確、快速分析。

3、標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)曲線:

4、再現(xiàn)性:

由多個不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定了精密度,圖2顯示出三聚氰胺檢測試劑盒的精密度情況,獲得的標(biāo)準(zhǔn)吸收值的變異系數(shù)(%CV)對相應(yīng)三聚氰胺濃度作曲線,可以看到在全部范圍內(nèi)變異系數(shù)如此之低,可以得到很好的再現(xiàn)性。

注意事項(xiàng)   

1、 使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標(biāo)本沒有回到室溫(20-25℃)會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,則會伴隨著出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

3、 混合要均勻,否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4、 反應(yīng)終止液為2M硫酸,避免接觸皮膚。

5、 不要使用過了有效日期的試劑盒,稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進(jìn)自封袋密封;標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感,因此要避免直接暴露在光線下。

7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì),應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個單位(A450nm< 0.5 )時,表示試劑可能變質(zhì)。

8、 該試劑盒zui反應(yīng)溫度為25,溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

【儲存】

原包裝應(yīng)儲存于28℃保鮮冷藏,切勿冷凍。

【有效期】

有效期12個月;生產(chǎn)日期、有效期、生產(chǎn)批號見外包裝。

 

原創(chuàng)作者:上海極威生物科技有限公司

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